Приложение №1 "Методические рекомендации "Этиология, эпидемиология и диагностика ВИЧ-инфекции"

МЕТОД ИММУНОБЛОТА

ВИЧ имеет сложный антигенный состав. Всего в его составе имеются 9 структурных белков (антигенов), которые подразделяются на 3 группы: оболочечные, сердцевинные и ферментные:

ПРИМЕЧАНИЕ: цифры-молекулярный вес белков в килодальтонах, р-протеин, др.-гликопротеид.

Принцип метода основан на том, что вирус разрушают с помощью детергентов, и он распадается на отдельные антигены. Затем антиген прогоняют электрическим током через молекулярное сито в полиакриламидном геле. При этом белки с низким молекулярным весом двигаются быстрее, а крупные белки с трудом проходят сквозь сито и двигаются медленнее. Затем белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану и разрезаются на полоски (стрипы).

В зависимости от молекулярного веса каждый антиген занимает на полоске определенное место в соответствии с его молекулярным весом.

Антитела, содержащиеся в сыворотке, реагируют с соответствующим антигеном и прикрепляются к нему. Для выявления комплекса антиген-антитело,

как и в ИФА, используется конъюгат и окрашивающийся субстрат. Там, где произошло образование комплекса антиген-антитело-конъюгат, происходит окрашивание участков нитроцеллюлозы в виде полос, соответствующих расположению антигена.

Как было указано выше вирус имеет следующие антигены, которые располагаются на стрипе в последовательности, соответствующей их молекулярному весу: gр.160,120, р.66,55,51, gр.41, р.24,18.

В соответствии с рекомендациями экспертов ВОЗ результаты, полученные в иммуноблоте, интерпретируются как положительные, сомнительные или отрицательные по следующей схеме:

Положительные: обнаружены антитела не менее чем к 2-м оболочечным белкам из 3-х (gр.160.120,41).

Сомнительные (неопределенные): обнаружены антитела к одному или нескольким вирусным белкам, но не выявляются антитела к 2-м оболочечным белкам.

Отрицательные: не содержат антитела ни к одному из белков вируса.

В случае положительного результата – подтверждается диагноз ВИЧ-инфекции.

В случае сомнительного результата необходимо провести повторное исследование через три месяца и при сохранении таких же результатов – еще через три месяца. При получении сомнительного двукратного результата образец сыворотки исследуется методом ПЦР.

Отрицательный результат ПЦР свидетельствует об отсутствии антител к ВИЧ.

Определение количества CD4-лимфоцитов.

Для уточнения степени и характера иммунодефицита используют методы оценки иммунного статуса. К ним можно отнести:

- Определение абсолютного и относительного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови.

- Определение абсолютного и относительного количества субпопуляций Т-лимфоцитов СД4 (Т-хелперов). Определение концентрации молекул СД4 на поверхности Т-хелперов.

- Определение СД8 Т супрессоров/киллеров и соотношение СД4/СД8.

- Определение гуморального иммунитета (содержание иммуноглобулинов М, G , А, Е).

Снижение количества лимфоцитов проявляется с бессимптомной стадии и длится в течение всей болезни. Лимфопения, нейтропения повышают чувствительность к ВИЧ-инфекции и являются прогностически неблагоприятными признаками. Снижение количества Т-хелперов (СД4) является главным прогностическим показателем Т-клеточного иммунодефицита при ВИЧ-инфекции.

Измерение уровня CD4-лимфоцитов позволяет судить о глубине развившегося у больного иммунодефицита. Уровень снижения количества CD4

клеток может служить критерием для определения вероятности возникновения тех или иных вторичных заболеваний.

Определение уровня CD4 лимфоцитов проводят с помощью моноклональных антител на проточном цитофлюориметре. В норме количество Т-хелперов колеблется от 500 до 1500 в 1 мкл.

Снижение абсолютного количества их до 350 и ниже говорит о прогрессировании ВИЧ-инфекции и развитии СПИДа.

Определение количества СД8 Т-супрессоров проводится аналогично определению СД4 Т-хелперов. Увеличение количества СД8 отмечается на ранней стадии ВИЧ-инфекции. Соотношение СД4/СД8 соответстсвует 1,5-2.

Забор крови для СД4 производит специально обученный медицинский персонал со средним образованием, с регистрацией данных в журнале (ф-515/у). Забор осуществляется натощак из локтевой вены в специальные пробирки вайкутейнеры с ЭДТА (с сиреневыми крышками) в количестве 5 мл. После сбора крови пробирки необходимо осторожно переворачивать от 5 до 10 раз для предотвращения свертывания крови. Сильно не перемешивать. Пробирки с кровью до отправки в лабораторию хранят при комнатной температуре не более 6 часов и далее при 2-8⁰ С не более 24 часов. Пробирки с кровью должны быть доставлены в лабораторию в день забора в штативах помещенных в сумки холодильники.

В лабораториях кровь исследуется согласно применяемой методике на СД4.