29.12.2007
Приложение № 4
Порядок бактериологических исследований при острых диареях****
(методические указания)
I. Исследуемый контингент: больные и лица, подозрительные на заболевание острой диареей, реконвалесценты, бактерионосители.
Правила забора биоматериала, порядок доставки и этапы исследования:
Биоматериал – испражнения, моча, рвотные массы, промывные воды, желчь, секционный материал должен собираться в стерильную посуду не содержащую следов дез.растворов, до начала антибиотикотерапии.
Кровь от лихорадящих свыше 3-х дней больных, в объёме 10-20 мл (в зависимости от срока заболевания) засевается в питательную среду 1:10 (предпочтительно брать питательную среду с желчью) у постели больного.
Испражнения засевают сразу после взятия или не позднее 2-х часов после взятия. Во всех других случаях испражнения необходимо поместить в консервант в соотношении 1:3 и должны быть доставлены в лабораторию в течении 12-24 часов. При подозрении на кампилобактериоз лучше использовать в качестве транспортной среды тиогликолевую. Материал в консерванте необходимо сохранять до начала исследования при температуре +4о-+6оС.
При заборе материала на холеру так же используют стерильную посуду не содержащую следов дез.раствора. При наличии у больного диареи, забирают 10-20 мл материала, при легкой форме течения 1-2 грамма испражнений в транспортную среду - 1% пептонную воду, или 2% раствор поваренной соли. Материал на 1% пептонной воде должен быть доставлен в лабораторию в течении 2 часов с момента забора, а на 2% растворе поваренной соли в течение 12-24 часа.
Бактериологические исследования на патогенные энтеробактерии (сальмонеллы, шигеллы), на УПЭ (цитробактер, протеи и др.) проводят в бактериологических лабораториях инфекционных больниц, районных, городских, областных и республиканских ЦГСЭН.
Этапы бактериологического исследования на энтеробактерии
I этап - посев крови на 10-20% желчный бульон 1:10.
Посев испражнений и другого материала:
а) прямой посев на плотные селективные и элективные питательные среды: ВСА, среды Плоскирёва, Эндо, ЭМС (Левина);
б) в среду накопления (селенит. бульон или хлормагниевую среду) в соотношении 1:5.
От больных и лиц, подозрительных на ОКИ, диагностический посев производится на ВСА - для обнаружения сальмонелл, на среды Плоскирёва, Эндо, ЭМС для обнаружения шигелл и сальмонелл и на среду Эндо на УПЭ.
Посев патологического материала от больных с установленным диагнозом, от реконвалесцентов, бактерионосителей производится целенаправленно: при тифо-паратифах, сальмонеллёзе - на ВСА и среду накопления, при бактериальной дизентерии - на среду Плоскирёва, Эндо или Левина.
На этом этапе можно брать сыворотку крови для постановки серологической реакции. Сыворотку крови больных хранить в холодильнике без эритроцитов до получения второй сыворотки через 5-7 дней после взятия первой.
Серологическую реакцию с диагностикумами ставить одномоментно с двумя сыворотками – постановка реакции с парными сыворотками в динамике.
Все посевы инкубируют в термостате при t-37oC.
II этап - исследования крови. Из гемокультуры производятся высевы через 6-8 часов ускоренная диагностика, через 18-20 часов (1-й высев), через 48-72 часа (2-й и 3-й высевы) и при отрицательном результате - на 6-е и 10-е сутки инкубации в термостате (4-й и 5-й высевы) на среду Эндо (или ЭМС без антибиотика), или бромкрезоловую среду или слабощелочной агар.
При положительном высеве выделенная гемокультура, подозрительная на сальмонеллы или шигеллы, исследуется также как и копрокультура.
Исследование испражнений и др. патологического материала.
а) Отбор подозрительных колоний с ВСА(висьмут сульфит агар) - чёрные колонии с блеском или без блеска, оставляющие чёрный след на среде или зеленоватые колонии без черного следа.
Посевы на ВСА просматривают через 24 и 48 часов инкубации.
Подозрительные колонии на среде Плоскирёва – бесцветные, полупрозрачные, нежные могут быть очень мелкие.
На средах Эндо, ЭМС – колонии могут быть слегка окрашены. Посевы просматривают через 24 часа, однако шигеллы дизентерии I (Григорьева - Шига) растут замедленно и дают очень мелкие колонии на среде Плоскирёва.
Отбирают не менее 2-х однотипных колоний с каждой среды. Отвитие подозрительных колоний производится на любую комбинированную среду типа 3-х сахарного агара (среда Олькеницкого), среду Клиглера, Рессель с мочевиной или без неё и определяется оксидазный тест.
б) Из среды накопления производится высев на плотные среды: ВСА, а в случае отсутствия данной среды, среды Плоскирёва, Эндо или ЭМС с последующим изучением подозрительных колоний, начиная со II-го этапа исследования (II a).
Если прямой посев испражнений на плотные среды (ВСА, Плоскирёва, Эндо, ЭМС) дал рост сальмонелл или шигелл, то изучение выделенной культуры из среды накопления можно не производить, однако дубликаты культур необходимо сохранять до конца исследования.
Все посевы инкубируют в термостате при t-37оС 18-24 часа.
III этап-учёт характера изменений на комбинированной среде.
Патогенные энтеробактерии – сальмонеллы, шигеллы не ферментируют лактозу (сахарозу) – цвет скошенной части среды не меняется. Некоторые сальмонеллы и шигеллы способны ферментировать эти углеводы в более поздние сроки, но не в первые сутки.
Сальмонеллы, как правило, образуют сероводород (почернение среды в столбике) на 3-х сахарном агаре и среде Клиглера.
Глюкоза ферментируется до кислоты – изменяется цвет столбика среды в зависимости от индикатора или до кислоты и газа – наблюдаются изменение цвета столбика среды и разрывы среды в столбике.
Если среда содержит мочевину (3-х сахарный агар или Рессель с мочевиной), то сальмонеллы и шигеллы её не утилизируют и щелочение среды не происходит.
Все подозрительные культуры сохраняют до конца исследования, для идентификации используют 1-2 культуры, которые изучаются в «цветном» ряду по биохимическим свойствам.
При подозрении культуры на сальмонеллу (изменение цвета среды в столбике, газ из глюкозы или без газа; наличия сероводорода; цвет косяка не меняется) можно поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сальмонеллёзной сывороткой АВСДЕ и при её отрицательной реакции – с агглютинирующей сальмонеллёзной сывороткой редких групп.
При подозрении на брюшнотифозную культуру выдаётся предварительный положительный ответ.
Пересев с комбинированной среды – 3-х сахарный агар, или среда Клиглера или Рессель с мочевиной, производится на «цветной» ряд из одной пробирки, а другие дубликаты сохраняются до конца исследования. Их можно использовать, если культура, взятая для идентификации, будет загрязненной или даст отрицательный результат.
В «цветной» ряд обязательно включать:
- агар с фенилаланином (для дифференциации патогенных энтеробактерий, некоторых УПЭ от протеев, провиденция),
- цитратный агар Симмонса,
- ацетатный агар (для дифференциации патогенных энтеробактерий от эшерихий и др. УПЭ),
- полужидкий агар с маннитом и индикатором для определения ферментации маннита и подвижности,
- питательный бульон для определения индола (сальмонеллы индол не образуют),
- среду с мочевиной, если в комбинированную среду не входила мочевина, (патогенные энтеробактерии фермент уреазу не продуцируют),
- постановка реакции Фогес-Проскауэра и с метиловым красным (для определения путей ферментации глюкозы с образованием ацетилметилкарбинола и 2,3-бутиленгликоля),
- среду с лизином,
В сомнительных случаях для определения принадлежности выделенной культуры к семейству кишечных бактерий (энтеробактерий) в «цветной» ряд необходимо включить среду Хью – Лейфсона ( O/F тест), на который выявляют окисление и ферментацию глюкозы, что характерно для всех энтеробактерий и определяется наличие или отсутствие газа, т.к. на комбинированных средах результаты газообразования могут быть нечёткими.
Все посевы, включая и комбинированную среду, инкубируют при t-37оС 18-24 часа.
С комбинированной среды из конденсата можно сделать посев штрихами на пластинке питательного агара в чашке Петри для постановки пробы с монофагами: на сальмонеллы (бактериофаги тифи, тифимуриум, энтеритидис, анатум), на шигеллы (бактериофаги Флекснера, Зонне, Ньюкастл и поливалентный, а так же фаг-дизентерия 1,2,3).
На одной чашке с питательным агаром можно изучать до 6-8 культур с сальмонеллёзными или шигеллёзными бактериофагами.
Результаты фаготипирования учитывают через 8-12 и 20 часов инкубации в термостате при t-37оС. Результат считается положительным при наличии любого лизиса – сливного или отдельными бляшками.
На этом этапе к выделенной культуре можно провести исследование чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков по общепринятой методике ( культуру берут с комбинированной среды).
IV этап – Учёт изменений на «цветном» ряде.
Сальмонеллы ферментируют маннит, подвижные, индола не образуют, растут на цитратной среде Симмонса, в зависимости от подгруппы сальмонелл (исключение S.typhi), ацетатной среде (исключение S.typhi), ферментируют дульцит, сорбит. Сальмонеллы 1-ой подгруппы не утилизируют малонат натрия. Все сальмонеллы не имеют фермента фенилаланиндезаминазы – не дают зеленого окрашивания с хлорным железом и дают положительную реакцию на среде с лизином (исключение сальмонелла паратифа А); не утилизируют мочевину.
Шигеллы не ферментируют (подгруппа А) или ферментируют маннит (подгруппа В,С,Д), неподвижные. Индола не образуют: Shigella dysenteriae 1,3,4,5,6,9,10,11,12; Shigella flexneri 6; Shigella boydii 1,2,3,4,6,8,10,12,14; Shigella sonnei; oбразуют индол: Shigella dysenteriae 2,7,8; Shigella boydii 5,7,9,11,13,15,16,17. Не растут на цитратной среде Симмонса, ацетатной среде, не имеют фермента фенилаланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу, не щелочат цитратную среду Кристенсена, не утилизируют мочевину.
Посевы на цитрате Симмонса, Кристенсена, на ацетатной среде и с малонатом натрия необходимо просматривать через 24 и 48 часов инкубации в термостате при t-37оС.
Учёт определения чувствительности к антибиотикам.
Учёт результата фаготипирования.
Реакцию агглютинации с адсорбированными шигеллёзными сыворотками нужно ставить после учёта биохимических свойств и отнесения выделенной культуры к роду Shigella. Агглютинацию культуры, подозрительной на сальмонеллу, можно проводить сразу после выделения чистой культуры на комбинированной (3-х сахарный агар, среда Клиглера и др.).
При наличии соответствующих культуральных, биохимических свойств, постановки РА с агглютинирующими адсорбированными сыворотками, положительной реакции с монофагами выдается положительный ответ.
Исследование на УПЭ у детей до 3 месяцев
2 ДЕНЬ Просматривают чашки, считают однотипные колонии, по 2однотипных колоний снимают на 3-х сахарный агар. Если есть рост подозрительных колоний на патогенную группу инфекций, их снимают и исследования проводят по общепринятой методике.
3 ДЕНЬ Ставят цветные биохимические ряды. Термостатируют при t- 37ºС
4 ДЕНЬ Изучают биохимические свойства выделенных культур, определяют родовую принадлежность энтеробактерий, дополняют тесты для определения вида. Если патогенных бактерий нет, а выделяются несколько видов условно-патогенных энтеробактерий, то энтеробактерией, имеющей этиологическое значение возникновения заболевания считается тот вид, который преобладает над другими на несколько порядков.
Однократного выделения возбудителя из испражнения недостаточно для постановки диагноза. Должно быть повторное выделение условно-патогенных энтеробактерий из испражнений больного острой диареей, как в монокультуре, так и в разведении не менее чем 10-6 и выше в первые 3 дня болезни и значительное снижение или полного исчезновения в последующие дни. Выделенная культура должна быть сохранена и использована в постановке реакции агглютинации с аутоштаммом.
Расчет КОЕ проводится по каждому виду по формуле КОЕ=АхВхС, где :
А- число выросших однотипных колоний на чашке;
В- посевная доза (коэффициент пересчета на 1 мл. равен 10, при посеве 0,1мл.);
С- разведение исходного материала.
Исследования на ЭПКП детей до 2 лет
1 ДЕНЬ нативный кал разводится посев на среду
с физ.раствором 1:10 ЭНДО
Термостатируют при t-37°C.
2 ДЕНЬ а) агглютинация части колоний (не менее 5) с поливалентной сывороткой ОКА.
б) часть колоний, давшие положительную агглютинацию на 3-4 креста, засевают на косяки нейтрального агара и на 3-х сахарного агара. Термостатируют при t-37°C.
3 ДЕНЬ а) агглютинация с нейтрального агара с ОКА культур с отрицательной реакцией на Н2Sи мочевины на 3-х сахарном агаре.
б) культуры, дающие положительные реакции с ОКА, агглютинируют с ОКВ, ОКС, ОКД, ОКЕ. Затем ставят цветные биохимические ряды с теми культурами, которые дали агглютинацию с одной из сывороток. Термостатируют при t-37°C.
4 ДЕНЬ а) если культура по биохимическим свойствам соответствует роду Escherichia, то проводят реакцию агглютинации с адсорбированными моновалентными ОК сыворотками или иммуноглобулинами, входящими в состав поливалентной сыворотки. Давшая положительную реакцию агглютинации с живой культурой (Н-антиген), определяют в агглютинационном тесте на стекле О-антиген с адсорбированными групповыми и факторными сыворотками. Для этого культуру смывают с нейтрального косяка, прогревают 30 минут при t-100° на водяной бане, затем центрифугируют, осадок используют для реакции агглютинации. При отсутствии ОК иммуноглобулинов и адсорбированных ОК сывороток, ставится развернутая реакция агглютинация в 2 ряда пробирок с разведенной ОК сывороткой. ОК сыворотку разводят до ее титра указанного на этикетке, начиная с разведения 1:50, 1:100 и.т.д.
В качестве диагностикума используют смыв культуры с нейтрального косяка, который делят на 2 части. Одна часть прогревается при t-100° 1 час и используется в качестве гретой культуры.
В качестве живой культуры используется смыв непрогретой.
В первый ряд пробирок вносят по одной капле живой культуры, во второй ряд пробирок - по 2 капли прогретой культуры. Контролем антигена является взвесь живых и прогретых культур в пробирках в том же объеме, что и разведенная сыворотка.
5 ДЕНЬ Учет результатов ведется через 18-20 часов инкубации при t-37°C. в термостате. Учет ведут не вооруженным глазом: живая культура – крупнохлопчатая, а агглютиноскопом: прогретая – мелкозернистая.
Результат оценивают как положительный при одновременном наличии К агглютината до титра (живая культура) или полтитра К антител указанного на этикетке, гретая культура (О-антиген) до титра или половины титра О-антител указанного на этикетке.
Кампилобактериозы
У больных ОКЗ материалом для бактериологического исследования служат образцы нативных фекалий, наличие крови в фекалиях является абсолютным показанием для бактериологического исследования на кампилобактериоз. Нативные фекалии подлежат немедленному бактериологическому исследованию, они разводятся в соотношении 1:10 стерильным физиологическим раствором или 0,1% пептонной водой и тщательно эмульгируются. Аналогичным образом подготавливаются к посеву образцы, доставленные на транспортной среде.
Ход исследований не имеет существенных отличий от такового при других кишечных инфекций.
1 этап: Традиционный метод – от больных ОКЗ фекалии, разведенные 1:10 физ.раствором засеваются на селективые питательные среды - железо-эритрит-кровяной агар (ЖЭКА), селективный эритрит агар с кровью, агар Кармали или селективный бескровный агар для кампилобактерий модифицированная среда (CCDA-Престона). Инкубация посевов осуществляется при t 420-430С в микроаэрофильных условиях (сжиганиесвечи помещенное внутрь с плотно притертой крышкой или. с использованием газовой смеси заводского изготовления содержащую 5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота) 24-48 часов.
2 этап: идентификация выделенной культуры. Необходимо определить принадлежность к роду Campilobacter и провести видовую дифференциацию термофильных кампилобактеров: C.jejuni, C.coli, C.laridis, которые играют ведущую роль в этиологии диарей.
На жидких питательных средах кампилобактеры через 48-72 часа инкубации при 42оС образуют равномерное помутнение с выраженным осадком. На полужидкой питательной среде в те же сроки образуют зону роста в виде диска, расположенного в 2-3 мм от поверхности питательной среды. На плотных питательных средах с кровью кампилобактеры образуют 2 вида колоний:
- плоская форма, зачастую с неправильными очертаниями, может быть круглой, 2-8 мм в диаметре, с ровными краями, бесцветные или светло-серые, прозрачные, гомогенные, напоминают капли воды, не способные к гемолизу. При длительном культивировании приобретают серебристо-матовый оттенок поверхности обладают невязкой консистенцией;
- колонии второго типа имеют правильную округлую форму, 1-2 мм в диаметре, ровные края, блестящую гладкую поверхность, заметно возвышаются над поверхностью питательной среды, прозрачны, гомогенны, хотя при длительном культивировании центр их несколько уплотняется в сравнении с периферией, чаще бесцветные, но при длительном выращивании способны к образованию желтоватого пигмента. Гемолиз не вызывают, обладают невязкой консистенцией. На плотных питательных средах с бактериологическим углем кампилобактер образует плоские, правильной формы округлые колонии диаметром 1-3мм, с ровными краями, белые, блестящие, полупрозрачные, гомогенные (напоминают по виду капли молока), склонные к врастанию в толщу питательной среды. На среде Кармали термофильные кампилобактеры растут в виде серых влажных плоских колоний после 42 часов инкубации при температуре 42оС.
Для доказательства принадлежности к роду Campilobacter используют следующие тесты:
1.Морфология клеток (S-образная формы или «крыло летящей чайки»);
2.Окраска по Граму и/или КОН-тест (грамотрицательны);
3.Оксидаза («+»).
Для видовой дифференциации основными тестами являются гидролиз гиппурата и устойчивость к налидиксовой кислоте.
Гидролиз гиппурата. В пробирке с 0,4 мл 1% водный раствор гиппурата натрия суспензируют полную петлю культуры. После 2-х часовой инкубации при 370С приливают 0,2 мл 3,5% раствора нингидрина в смеси ацетона и бутанола (в соотношении 1:1). После инкубации в течении 10 минут при 370С учитывают результаты. О положительной реакции свидетельствует появление интенсивной пурпурной окраски в виде кольца на границе водной и ацетон-бутаноловой фазы. Гидролиз гиппурата натрия вызывает только C.jejuni.
Устойчивость к налидиксовой кислоте определяется на среде Мюллер-Хинтона диско-диффузионным методом. Резистентность к налидиксовой кислоте наблюдается у C.laridis.
Дополнительные идентификационные тесты для термофильных кампилобактеров: температурный тест, рост в анаэробных условиях, устойчивость к цефалотину, ТТХ, продукция нитратредуктазы и др.
Для определения антибиотикорезистентности кампилобактеров используют метод дисков. Определяют чувствительность к 7 антибиотикам: карбенициллину, эритромицину, гентамицину, тетрациклину, канамицину, левомицетину и стрептомицину. При постановки теста рекомендуется применение сред без крови с инкубацией чашек в микроаэрофильных условиях.
ИЕРСИНИОЗЫ
Лабораторная диагностика иерсиниозов проводится в соответствии с приказом МЗ РУз №170 от 19 апреля 2004 года « О совершенствовании мер борьбы с иерсиниозами» (страницы 18-27).
Перечень и объём лабораторных исследований.
На уровне района – все патогенные и условно-патогенные энтеробактерии до вида.
На уровне области и г. Ташкента – патогенные энтеробактерии, УПЭ, кампилобактерии, иерсинии, определение биовара, антибиотиковара, фаготипирование.
На уровне Республики – патогенные энтеробактерии, УПЭ, кампилобактерии, иерсинии, определение биовара, антибиотиковара, фаготипирование.
__________
****Составители: Б.Д.Маткаримов (ГУСЭН), Н.З.Каршиева (РесЦГСЭН),
В.А.Пахомова (РесЦГСЭН), С.К.Алиева (РесЦГСЭН).
